Pharmaceutical Technology Brasil Ed. 3-19

Pharmaceutical Technology 88 Edição Brasileira - Vol. 23 / Nº3 FIGURA 5 Perfis temporais para densidade celular e cinética de crescimento em fermentadores. Biomassa e produção de GFP após ensaios com fermentadores. a produção de GFP e monitoramento de subprodutos. A produção de GFP recombinante foi induzida a OD600 = 25 ± 1 com IPTG. • Métodos analíticos: Após a inocula- ção, as amostras foram coletadas inicial- mente a cada 30 min e, em seguida, a cada hora e, finalmente, a cada duas horas para análise off-line. • Detecção Offline de Concentração de Biomassa: A densidade ótica do caldo de fermentação foi determinada a 600 nm (OD600) como uma medida da densidade celular. Amassa seca das células foi medida por secagem das amostras em um forno a 105°C durante pelo menos 5 horas. A concentração do peso de célula úmida (biomassa) foi calculada a partir da dife- rença de peso de tubos de centrífuga vazios de 5 mL e preenchidos usando amostras centrifugadas (10.000 rpm, 5 a 10 minutos) após a retirada do sobrenadante. • Determinação quantitativa de GFP por espectrofluorímetro e SDS-PAGE: A análise de GFP foi realizada usando um espectrofluorômetro equipado com todos os filtros relevantes de excitação e emissão GFP e com géis pré-moldados e tampão Laemmli em uma célula de eletroforese. Após a eletroforese, o gel foi corado com azul de Coomassie (por 1 h em uma mesa de agitação e descolorido (5% de ácido acético, 20% de etanol) até o fundo ficar transparente. O produto puro do gene GFP foi utilizado para quantificação com diferentes concentrações. Resultados Os perfis de crescimento de E. Coli Bl 21 em bio-screen usando diferentes extratos de levedura são apresentados na Fig 2. Quase todos os extratos de levedura mostraram propriedades de promoção de crescimento muito boas e até melhores do que os meios de referência comerciais (LB e TB). Aquelas que levaram às maiores taxas médias de crescimento e densida- des celulares foram selecionadas para os subsequentes frascos de agitação (Fig. 3) e experimentos com fermentadores (Figs 4,5,6 e 7). Os experimentos nos frascos de agi- tação foram efetuados na perspectiva de avaliar a contribuição de uma peptona de base animal amplamente utilizada, conhe- cida como triptona (encontrada em meio de referência, tal como LB e TB) e peptona de levedura (HYP-A), ambas associadas a extratos de levedura selecionados para o crescimento de E. coli Bl 21 (Fig. 3). Nossos resultados sugerem que a peptona deriva- da de levedura HYP-A pode, curiosamente, substituir a triptona em formulações de meios de bioprodução. A cinética de fermentação com curso de tempo de densidade ótica, pH, DO e velocidade de agitação é mostrada na Figura 5. A DO foi controlada em 30% aumentando a velocidade de agitação e a taxa de fluxo de ar. No entanto, estava abaixo do ponto de ajuste e até mesmo no nível mínimo durante um período em que a taxa de consumo de oxigênio das células estava no máximo, portanto a demanda não poderia ser satisfeita usando apenas ar. Como planejado, o pH da cultura dimi- nuiu do valor inicial de 7,2 na inoculação até o ponto de ajuste 6,8, principalmente devido à produção de acetato pelas célu- las. Após 10 horas, as células começam a consumir os metabólitos ácidos e / ou gerar componentes básicos, o que faz com que o pH aumente em relação ao ponto de ajuste. Em seguida, após mais 2 horas, há uma acidificação mais forte devido à rápida metabolização da glicose usada para os processos de batelada alimentada. Inoculação as células cresceram exponen- cialmente com as taxas de crescimento específicas que foram aplicadas (Fig. 5). O perfil de alimentação aplicado permitiu alcançar altas concentrações de biomassa celular seca e úmida, o que mostrou uma relação linear com a densidade ótica (da- FIGURA 4 Produção de biomassa e GFP após ensaios em fermentadores